干细胞研究进展-姚鹏

2012年02月06日星期一 16:39:17

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干细胞研究进展-姚鹏. 北京军区总医院全军肝病中心北京100700

干细胞定向分化为功能细胞并且应用于器官损伤的治疗，是目前生物学研究的热点，干细胞移植已应用于心脏，神经，血液病等疾病的治疗，干细胞用于人类肝脏疾病是人们关心的问题。

肝干细胞与肝脏

干细胞是指具有无限或可被延长自我修复能力的细胞，按分化能力而言分为：原始干细胞，具有多种分化能力，可以自我更新，并参与有机体的一生组织修复；前体细胞，存在于有机体某一组织器官内，仅向有限的几种组织细胞分化；成熟组织中的分化细胞，不能自我修复，不具有分化能力。肝干细胞属于前体细胞，来源于肝脏Herring（汇管区和终末小胆管的连接部分）狭隙和肝内胆管，具有双向分化潜能，能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞。这种细胞具有特殊的形态特征：形态较小、核浆比率高，具有卵圆形细胞核，故又称卵圆细胞^[2]。

早在1958年Wilsion等^[3]就提出假说：在肝组织中可能存在干细胞。之后人们在龌齿类动物的肝组织中发现了双向分化潜能的卵圆细胞，Yoshimichi等^[4]证实在人的肝组织中也存在这种双潜能的肝祖细胞。科学家进一步对卵圆细胞进行了克隆和鉴定，发现其在体外培养能够大量增殖，细胞移植后在形态和功能上可分化为肝细胞和胆管上皮细胞，这种具有强大增殖能力和分化潜能的细胞即为肝干细胞。肝干细胞及其生物功能的确认，使肝干细胞的研究进入了一个新的时代。以后大量的实验证实了肝干细胞的分化潜能。体外实验培养的肝干细胞经诱导可分化为肝实质细胞，植入动物体内肝干细胞也可分化为肝实质细胞及胆管上皮细胞，含肝干细胞的肝细胞悬液移植动物脾内可获得大量的由干细胞分化而来的肝实质细胞，并能够提高实验性肝衰竭动物的存活率；肝干细胞在正常情况下处于静止状态，但在肝再生能力受到毁灭性打击时，可以观察到肝干细胞的激活、增殖并向肝细胞等分化。此时肝干细胞的增殖与分化可能对肝损伤修复具有极为重要的意义。

肝干细胞是一族异源细胞群，表达肝细胞系及胆系不同的细胞形态标志。（表1）^[5]根据其形态特征及定位将其分为三个细胞型。I型细胞，具有原始的形态，定位于增生的胆管附近并且围绕肝细胞呈腺状排列；II型细胞，与I型细胞具有相似的共同形态特征，但只定位于胆管增生区，与胆小管细胞毗邻； III型细胞，具有I型细胞的共同特征，并具有成熟肝细胞的形态，即突出的细胞核和丰富的细胞浆。

在大鼠也发现了类似的三种具有不同免疫学特性的细胞群：原始的卵园细胞，不表达甲胎蛋白（AFP）, 角蛋白19（CK19）, OV-6 或谷胱甘肽S-转移酶（-GST）;肝细胞样卵园细胞，表达 AFP, 但不表达OV-6 or -GST; 胆管样卵园细胞, 不表达 AFP 但表达CK19, OV-6 和 -GST。大多数卵园细胞表达胚胎和胆管特异的细胞标志，只有少数细胞共同表达胚胎和成熟肝细胞标志。^[6]
Marker
标志
Oval Cells
卵园细胞
Hepatocytes
肝细胞
Bile Duct Cells
胆管细胞
Albumin
+
+
-
AFP
+
Fetal
-
-GST
+
Fetal
+
CK18
+
+
+
CK19
-/+
-
+
OV-6
+
-
+

肝干细胞的来源

肝干细胞的起源问题目前仍然是一个有争议的问题。目前认为，存在三种肝脏相关的增殖细胞， (1). 成熟的肝细胞；(2).组织内干细胞，来源于成熟肝内终末胆管；(3).多潜能干细胞，来源于骨髓干细胞。

卵园细胞的存在，最初是在2-乙酰氨基芴（2-AAF）处理的小鼠肝内，发现有卵园细胞的诱导增殖，表达AFP，因此推测卵园细胞可能来自肝内定位的前体细胞。进一步研究显示，增殖及分化为肝细胞的前体细胞首先发现在Hering管^[7]，因此认为，Hering管是肝祖细胞及其子代卵园细胞的来源。

Suzuki等^[8]在发育的小鼠肝脏分离出一种肝干细胞群，称为肝细胞克隆形成单位（H-CFU-C）, 具有多向分化的潜能及自我更新的能力。然而,不象卵园细胞,它们不表达肝细胞及胆管细胞特有的细胞标志。它们能够在体外扩增并且在体内重构肝细胞、胆管细胞、胰岛及肠上皮结构。这种细胞可能代表定居肝内的肝祖细胞。

肝干细胞可能来源于肝内，也可能来源于肝外。造血系统可能是肝干细胞的肝外来源。典型的造血细胞标志，包括Thy-1, c-kit 和 CD34，均表达在卵园细胞的表面。1999年Petersen 等^［^9］观察到大鼠骨髓细胞的部分能在肝脏生成卵圆细胞，并能进一步分化为肝细胞和/或胆管细胞，为了证实他们的结果，进行不同的实验：(1)骨髓细胞采自雄大鼠，受体鼠为雌鼠，结果在雌鼠肝脏检测到Y染色体阳性细胞；（2）全肝移植实验，受体鼠为Lewis大鼠（表达L21-6抗原），供体鼠Brown-Norway大鼠（不表达L21-6抗原），发现受体肝细胞表达移植细胞标志. 2000年6月 Alison MR和 Theise ND分别报道，一个女性患者接受一个男性供体骨髓，一个男性患者接受了一个女性的肝移植，在受体肝细胞中都检测到了Y染色体^［^10］。骨髓来源的细胞可以单独分化为肝细胞，或同时分化为肝细胞和胆管细胞。因此，造血细胞能够迁移到肝脏并分化为肝细胞。

另外，从胰腺分离的胰岛前体细胞体外培养也可分化为肝样细胞^[11].这是否提示在胚胎发育过程中，一些原始的多能干细胞一直保持着未分化状态，滞留在机体组织内。无论怎样，研究肝干细胞的起源是一个十分重要的课题，对于肝干细胞的进一步基础及临床应用研究具有重要意义。

细胞因子与肝干细胞

在肝干细胞的激活、增殖及分化过程中，细胞生长因子起着重要的作用。有报道，在2AAF处理后部分肝切除的动物模型，许多细胞因子包括肝细胞生长因子（HGF）、纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF-β）等因子的水平迅速升高，参与肝内各种细胞，包括肝细胞、胆管细胞、肝星细胞等的增殖调控，从而使肝结构及功能得以重建。 Robert J.I等^[12]发现，Oval细胞能高水平表达HGF、FGF、EGF、TGF-β等生长因子受体蛋白，提示细胞因子通过与其受体结合起作用。研究还表明HGF、FGF、EGF、胰岛素等可以促进Oval细胞的增殖，而TGF-β则具有抑制Oval细胞增殖的作用，并可诱导凋亡发生。EGF是卵圆细胞的有丝分裂原，它可促进DNA合成和mRNA转录。

HGF是一种具有多种生物功能的细胞因子，可以促进细胞增殖，血管形成及抗凋亡等，并且在肝干细胞的激活及分化中起重要作用。HGF与其细胞表面的受体c-met结合后，引起细胞内一系列蛋白酪氨酸磷酸化，激活多种细胞内信号传导途径，最终导致细胞分裂增殖，分化等变化。有报道，在部分肝切除动物，AAF/PH处理后4小时HGF转录水平明显增高，提示HGF可能参与肝干细胞的早期激活^[13]。并且，C-met的表达也逐步上升，其间Oval细胞的增殖非常明显, 表明HGF在Oval细胞的激活增殖中起作用。Ritva PE等报道^[14]，Oval细胞在HGF等因子的存在下能够向肝细胞定向分化， HGF还能够诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞。表明，HGF在肝干细胞的生长分化调控中起重要的作用。

EGF家族在Oval细胞的激活增殖中亦有重要作用。研究发现，在PH后大鼠的肝修复过程中，EGF水平明显升高。并且，Oval细胞表达EGF受体，而EGF能够在体外促进Oval细胞的生长，提示EGF参与了肝干细胞的增殖调控，这种调控是通过与其在细胞表面的受体结合进行的。FGF-α能够参与多种细胞功能，包括细胞的增殖分化、血管的形成及细胞迁移。在部分肝切除动物，FGF-α转录水平的升高比HGF晚24小时，因而推测FGF-α不参与早期肝干细胞的激活，而是参与肝结构的形成及干细胞子代细胞的增殖分化。

TGF-β属于结构相关调控因子超家族，包括三种TGF-β亚型（TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3），介导许多生理过程包括细胞增殖，修复，癌变和程序性死亡。TGF-β是一种肝细胞生长终止及凋亡的信号，在大鼠异源移植的干细胞发生凋亡过程中TGF-β增高。同样，TGF-ß被认为是一种调控肝干细胞分化生长的重要因子，Park DY等^[15]报道TGF-ß能够诱导肝干细胞凋亡，从而抑制肝干细胞的过度增殖，这在肝损伤的修复、防止干细胞突变及肝肿瘤的发生中可能有重要意义。在鼠肝细胞，TGF-β能够选择性下调核转录因子NF-kB的活性并且导致细胞死亡，提示TGF-β介导的信号可能通过NF-kB活性来调控细胞的生存与死亡。

白细胞介素6（LI－6）也是一种肝干细胞调控的重要因子。对于LI-6在卵圆细胞增殖中是否必须，尚存在着争论。有研究报道^[16]，抑制LI-6的产生导致卵圆细胞的减少，表明，LI－6参与卵圆细胞的激活。然而，另有报道，在LI-6基因敲除小鼠，仍然可以见到卵圆细胞增殖，并且在损伤10天后，所有小鼠的肝损伤均完全恢复，提示LI-6对于卵圆细胞的增殖并非必须。可能是LI-6家族的其他成员，包括白血病抑制因子（LIF）和／或制瘤素（OSM）,补充了LI-6在这些小鼠的缺失。在2－AAF／PH诱导的卵圆细胞增殖其间，LIF增加并保持高水平，提示，其在卵圆细胞的扩增及分化中起作用。另外，在卵圆细胞表达LIF及LIF受体， OSM被认为参与体外及体内胎肝细胞的成熟，并且在卵圆细胞的肝细胞分化中也可能起同样的作用。

干细胞因子(SCF)和它的受体c-kit，在各种干细胞的增殖、分化和迁移中起关键作用，并且可能同样影响卵园细胞。干细胞因子在2-AAF/PH激活卵园细胞的早期即诱导产生，卵园细胞的前体细胞既表达SCF 也表达 c-kit，表明可能存在一个自分泌机制。然而，这种受体与配基系统在肝再生中的确切作用还不清楚。在c-kit受体严重缺陷的Ws/Ws大鼠，卵园细胞的产生明显受到抑制。表明SCF/kit系统在卵园细胞的激活中起重要作用，要么通过调节在肝内的肝祖细胞的数量，要么使肝祖细胞分化为卵园细胞。

卵园细胞介导肝再生

在对肝细胞损害的反应中,肝脏启动一种免疫应答机制,分泌一系列复杂的细胞因子和化学增活素。这些信号将促进Kupffer细胞和星细胞浸润到损害区域和一些肝细胞再生受阻的区域，肝祖细胞可能通过释放的诱导趋化因子如SCF，从骨髓中募集而来。肝祖细胞迁移到肝脏并且通过Hering管浸润到肝小叶。此外，肝内定居的原始细胞，如 H-CFU-C's可能是肝祖细胞的另一来源。这些肝祖细胞生成卵园细胞，应答Kupffer细胞和星细胞释放的不同的细胞因子。Kupffer 细胞释放一系列细胞因子，包括EGF, aFGF, TGF-、 HGF和TNF，刺激卵园细胞的增殖、分化，参与肝损伤的修复及肝细胞再生。最后，Kupffer细胞和星细胞释放的TGF-触发卵园细胞的凋亡机制，并且最终导致卵园细胞介导的肝再生停止。这样，Kupffer细胞、星细胞和卵园细胞释放的细胞因子协同作用，调控卵园细胞的增殖和肝实质的重构。

不论肝干细胞来源如何，有一点已证实，肝干细胞的增殖发生在肝细胞的增殖能力和功能受到损害时侯。它们增殖并且迁移到损坏的肝小叶替代损失的实质。在包括HBV/HCV感染、药物和酒精性肝病等病理过程中，均可见到卵圆细胞的出现^[22]。对调控这一过程的因子和激活卵园细胞机制的阐明，将有助于理解卵园细胞的生物功能，并且了解骨髓来源肝干细胞和卵园细胞之间的联系，将促进对卵园细胞介导肝再生机制的研究。

肝干细胞的应用

肝干细胞研究具有巨大的应用前景^[17]，将在发育生物学、基因功能、细胞治疗和组织细胞替代治疗等领域发挥重要作用，肝干细胞本身及诱导分化产生的肝实质细胞可以广泛应用于基因治疗、肝细胞移植及生物人工肝等诸多方面。

干细胞移植治疗肝脏疾病

我国肝功能衰竭发生率较高，其病理特点是大块或亚大块肝细胞坏死，而残存肝细胞的增生受到多种因素的抑制，依赖病变肝脏自身能力引发肝再生有很大困难.肝移植技术由于供体的数量、昂贵的价格等因素，而受到限制.因此，应用肝干细胞进行细胞移植治疗肝病患者，是可行的方法.

Shi Z等^[18]经脾脏进行胚胎干细胞移植治疗Wilson’s病模型鼠，移植后在肝内可见胚胎干细胞来源的肝细胞增殖，说明脾脏内移植的胚胎干细胞有分化为成熟肝细胞的能力。苏娟等^[19]用人胎肝干细胞在小鼠脾内移植，移植后发现胎肝干细胞能在损伤肝脏中增殖并分化为肝细胞。Akushida T等^[20]通过门静脉进行干细胞移植治疗Wilson’s病小鼠，移植后肝内发现干细胞来源的肝细胞。我们成功地^[21]采用患者自体骨髓分离纯化骨髓干细胞，经肝动脉方式移植入肝脏治疗慢性肝功能衰竭。初步临床应用结果显示，患者接受自体骨髓干细胞移植治疗后肝功能改善且临床症状有所改善。然而，由于该项目开展的时间较短，病例数有限，对于其疗效和副作用的准确评估还需要进一步观察。

在生物人工肝中的应用前景

人工肝支持系统是终末期肝病患者度过危险期或肝移植等待治疗的手段之一，然而，获取足够数量的肝细胞供临床应用十分困难，猪肝细胞作为肝细胞源已广泛应用，但尚存争议.干细胞具有很强的的再生能力及定向分化潜能，将干细胞在一定条件下培养扩增，诱导分化成为成熟肝细胞，作为肝细胞源，将具有很好的应用前景.

基因治疗对于遗传性代谢障碍方面的肝脏疾病，可以利用转基因技术将缺陷基因转入干细胞，筛选出阳性细胞移植入患病肝脏，纠正代谢机能障碍。

总之，肝干细胞的研究尚处于初期阶段，目前的研究已取得了长足的进展，已挑战了传统的细胞生物学理论。为研究肝脏分化发育、了解肝脏疾病的发生及治疗提供了有效的方法。相信在不久的将来，肝干细胞会在肝病的细胞治疗、组织工程和基因治疗方面发挥越来越重要的作用，为肝病的治疗开辟崭新的途径^[22]

2012-02-06

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